陈红松 李若冰 魏 来 王 宇 北京大学人民医院肝病研究所 100044
一般认为,HBV感染人体后,易于逃避免疫系统的监视,使机体处于免疫耐受状态,而形成持续感染。研究表明,慢性乙肝患者体内针对乙肝病毒的特异性CTL反应很弱、甚至检测不到,因此在治疗慢性乙肝时,一个重要的战略是,提高T细胞对HBV的识别,产生有效的免疫反应。Chisari给HBV转基因小鼠输入经细胞因子活化的DC就可以打破这种耐受,在转基因小鼠体内诱导特异的抗HBV的CTL反应。树突状细胞(DC)是体内最强的抗原呈递细胞,在调节细胞介导的免疫反应时起重要作用,由于DC表达协同刺激分子和粘附分子,因此诱导初始型T细胞反应,目前DC作为佐剂用于治疗黑色素瘤、前列腺癌等已取得很好的效果,但部分研究表明DC在肿瘤发生后功能下降,DC的功能与疾病的状态相关,因此如果将DC作为免疫治疗的工具就应首先评价其功能状态,目前对于HBV慢性感染状态的乙肝患者DC功能状态的认识并不深入,因此本文拟通过培养慢性乙肝患者DC,并从形态学、细胞表面标志及功能上进行研究,并将慢性乙型肝炎患者外周血DC用乙肝病毒C抗原的CTL抗原表位多肽刺激后,通过细胞内细胞因子染色(1CCS)方法检测DC能否诱导特异的T细胞应答,并讨论将DC应用于乙肝生物治疗的可能性。
材料与方法
1.研究对象:慢性乙型肝炎患者10例来自河北省,平均年龄38.3岁(26—45岁),男女各5例,无其它器官合并症。健康献血员10例,平均年龄35.2岁(32—40岁),男4例,女6例。ICCS检测特异的T细胞应答实验中慢性乙肝患者组包含7例慢性乙型肝炎患者,均来自河北省,男4例,女3例,年龄23-49岁,平均35.3土13.6岁,纳入标准:HLA—A* 02阳性,ALT>80U/L,HBsAg、HBeAg、抗HBC均阳性(采用ELISA法检测,试剂盒购自阿克苏公司),排除HAV、HCV、HDV、HEV感染。急性乙肝痊愈者组包括4例急性乙肝患者,均来自2001.12-2002.3地坛医院住院病人,男女各2例,年龄21-44岁,平均34.5+-8.4岁,纳入标准:HLA—A*02阳性,ALT<401U/L后3月,HBsAg、HBeAg、抗HB均阴性,抗HBS阳性,排除HAV、HCV、HDV、HEV感染。以上诊断均符合2000年病毒性肝炎防治方案(中华医学会传染病与寄生虫学分会、肝病学分会联合修订)。正常志愿者6例,平均年龄23—26岁,平均30.6±5.6岁,纳入标准:HLA-A*02阳性,ALT<401U/L,乙肝标志物均阴性,无其它免疫系统合并症。
2.主要试剂:rhGM—CSF(1eucomax)购自先灵葆雅公司,rhTNF—a,rhIL—4由北京大学医学部免疫室提供,淋巴细胞分离液(1.077g/ml)购白天津血研所。荧光标记鼠抗人单克隆抗体:抗HLA—DR—PE、抗CD86—FITC、抗CD80—PE、抗CD54—PE、抗CDl4—FITC、抗CDllC—PE、抗CD3—FITC/CDl9—PE、抗CD4—FITC、抗CD8—FITC、抗IFN—r—PE等来自美国BD公司;鼠抗人特异性抗体:抗CD83、抗CDla;羊抗鼠单克隆抗体:IgG(H+L)—RPE、IgG(H+L)—FITC抗体和PE标记鼠抗体IL—2、TNF—a单克隆抗体、细胞内染色相关试剂均来自Pharmigen公司。无血清培养基AIM—V、RPMll640购自GIBCO公司,IL—12ELISA试剂盒购自Endogen公司。鼠抗人HLA—A*02单克隆抗体(BB7.2细胞株)由北京大学医学部免疫系陈慰峰教授惠赠。
3,HLA—A*02型另Ij鉴定:
每名献血员取200ul新鲜抗凝全血,每管100ul加人流式细胞仪检测管中,再加入200ml溶血素反应12分钟后离心(1250rpm 5min 4摄氏度)弃上清,PBS洗细胞两次,其中反应管加入鼠抗人HLA—A* 02抗体(BB7.2细胞株培养上清)100ul,4摄氏度30分钟孵育后,PBS再次洗细胞,每管加入PE标记羊抗鼠Ig2ul,4摄氏度30分钟孵育后,PBS洗涤,FACS固定液200ul加人每管,4摄氏度保存用于流式细胞仪检测。
4.PBMC制备:
取研究对象新鲜抗凝外周血,用RPMll640不完全培养基以1:1比例稀释,并缓慢加入淋巴细胞分离液的液面上,经密度梯度离心后取白膜层细胞,不完全培养基洗细胞两次,调整细胞浓度,1X1000000/ml加入24孔板,每孔2m11640完全培养基。
5.树突状细胞的分离和体外培养:培养方法与文献相似,略有改动,慢性乙肝患者或健康志愿者抗凝外周血单个核细胞,以AIM—V悬浮细胞2X10000000/孔加人6孔板,37摄氏度 5%/C02孵箱培养过夜,第2日,轻轻吹
打,吸除非贴壁细胞,加入AIM—V 4ml,GM—CSF 1000u/ml ,IL—4 500u/ml,分别于培养第3、5、7、9、11、13、15天收获细胞及培养上清,细胞用于流式细胞仪(FACS calibur)检测,培养上清保存于—70摄氏度冰箱用于IL—12检测,培养第7天部分培养孔加入TNF—a20mg/ml,第9日收集悬浮细胞。
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慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的功能及其应用研究
作者:佚名 文章来源:肝病网 点击数: 更新时间:2012-9-27
- 核心提示:慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的功能及其应用研究的详细介绍,还有素及ManBetX官网在线登录腹水的治疗各种肝病症状和治疗方法,ManBetX官网在线登录知识的相关知识等。
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