治疗性疫苗-慢性乙型肝炎患者的希望

0   引言
    疫苗的概念是在200 a前Jenner发现事先接种牛痘能够阻止天花的发生之后首先提出的. 近100 a来，疫苗的开发和应用已成为医学科学的重大成就之一，且已广泛用于传染病的预防和治疗. 这些疫苗成功的原因在于他能够有效地诱导机体产生保护性抗体. 然而，对某些细胞内病原菌如结核杆菌、利什曼原虫以及寄生虫等这些抗体几乎不起作用，因为对这些病原体的防御更多地依赖于细胞免疫，而不是抗体介导的体液免疫. 对如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、疟原虫等感染，则可能需要细胞免疫和体液免疫的双重介导.
    
    1995年前医学界普遍认为，疫苗只作预防疾病用. 随着免疫学研究的发展，人们发现了疫苗的新用途，即可以治疗一些难治性疾病. 从此，疫苗兼有了预防与治疗双重作用，治疗性疫苗属于特异性主动免疫疗法. 现在准获使用的疫苗来自杀死或灭活的完整细胞、重组蛋白或减毒的活病原体，都能刺激机体产生抗体. 然而除了减毒活疫苗如水痘-带状疱疹病毒疫苗外，其他疫苗并不能特异的诱导细胞免疫，此外，如果用减毒活疫苗来预防诸如HIV之类的病毒感染，可能给疫苗制备和接种疫苗的人群带来危险. 因此，积极寻找既能同时诱导体液和细胞免疫应答又具安全性的疫苗，实乃当务之急. 最近出现的新型疫苗如核酸疫苗、T细胞疫苗、树突状细胞疫苗等彻底改变了疫苗多为蛋白、只能预防的经典概念，引进了治疗性疫苗和核酸及细胞疫苗的新内容，大大拓展了人们对疫苗组成和功能的认识，被称为是疫苗学的第三次革命. 因他们不但具有传统疫苗的一般功能，且能激发机体特异性细胞和体液免疫应答，用于临床现症患者的治疗. 故称之为新概念疫苗.
         
    新概念疫苗与传统疫苗的区别表现在:(1)成分不同:传统疫苗多为死疫苗/减毒活疫苗或重组亚单位疫苗；新型疫苗则为编码无毒力抗原蛋白的病毒核酸或能激发特异性机体免疫应答的细胞疫苗；(2)机制不同:传统疫苗主要靠病毒的抗原蛋白刺激机体产生中和性保护抗体；新型疫苗不仅能刺激机体产生保护性抗体，而且能激发特异性细胞免疫应答；(3)作用不同:传统疫苗只能起到一定的预防作用，新型疫苗不仅能预防疾病，而且更能起到特异的治疗作用，治疗性疫苗具有更广泛的应用前景.现就治疗性疫苗的新概念以及目前在慢性乙型肝炎中的研究现状作一简要的概述.

1   核酸疫苗
    所谓核酸疫苗(nucleic acid vaccine)，是将含编码外源蛋白基因的质粒DNA，直接导入动物组织，外源基因于体细胞中表达后，表达产物被提呈，与主要组织相容性复合物(MHC)结合，刺激机体产生相应的抗体和细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)，分别介导体液免疫和细胞免疫应答. 这种外源基因是抗原的来源，具有疫苗的功能，又称为DNA疫苗，由于不需任何化学载体，故又称裸DNA疫苗[1,2].
    
    1990年Wolff et al在做小鼠基因治疗试验时偶然发现，将编码基因的质粒DNA直接注射入动物肌肉细胞内，能在动物体内表达抗原并诱导机体产生免疫应答.这一发现打开了通往新的免疫途径的大门. 由于不加任何佐剂或载体，故又称裸DNA免疫.1994年在日内瓦召开的专题会议上将这种疫苗定名为核酸疫苗. 核酸疫苗的出现或许将是疫苗发展史上的一次革命. 现已做了大量的DNA疫苗的动物试验. 主要包括流行性感冒病毒、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、狂犬病毒、淋巴细胞性脉络丛脑炎病毒、疟原虫和支原体及肿瘤的预防和治疗研究等[3-9].
    
    迄今，国外已有至少4种DNA疫苗被批准进入I期临床试验. 1996年美国FDA批准对健康志愿者进行艾滋病DNA疫苗人体实验. 1998年MacGregor et al首次报道了DNA疫苗治疗艾滋病病毒HIV-1感染者的人体实验结果. 据最新消息，英国已经批准在今年8月开始进行一种专门针对非洲人的HIV DNA疫苗的I期临床试验. 1998年，美国海军宣布他们已经成功地在健康人体上检测了针对疟疾的DNA疫苗，他们认为这种疫苗最早得到广泛应用将可能在2005年. 目前，DNA免疫接种的领域正在迅速发展，已经发展的现行疫苗不仅使用DNA，而且还包括附加物，他有助于DNA进入靶细胞，或者起到佐剂的作用，刺激或诱导免疫应答[10-13].
1.2 乙肝病毒核酸疫苗  乙型肝炎核酸疫苗就是将乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)一种或几种抗原的编码基因直接注入宿主体内，该基因能在宿主细胞内转录和表达，并继而诱生特异的体液和细胞免疫应答. 这类疫苗不含蛋白质或多肽，仅含核酸，在体内表达后具有疫苗功能，被称作乙型肝炎核酸疫苗，包括DNA疫苗和RNA疫苗，主要是指DNA疫苗. 近年来兴起的核酸疫苗的研究已在乙肝的防治中显示出诱人的应用前景，引起了国内外学者们的关注. 与传统的血源疫苗和基因工程相比，乙肝DNA疫苗有很多优点，如:比乙肝血源疫苗相对安全;比基因工程多肽疫苗的制备简单、快捷; 性质更稳定，便于保存和运输; 乙肝DNA疫苗还可通过对目的基因的构建，选择所需的抗原决定簇，可以对同种异株的病毒产生免疫应答，发挥交叉保护作用. 更为重要的是，乙肝DNA疫苗可在机体的真核细胞中表达糖基化抗原蛋白，并可按照病毒抗原的天然构象进行折叠，模拟了病毒的自然感染过程，不仅可以诱导针对HBsAg的保护性抗-HBs产生，而且可以同时诱发特异的细胞免疫，所以兼有预防和治疗作用，不久的将来乙肝病毒核酸疫苗将应用于临床[14,15].

2   T细胞疫苗
    T细胞疫苗原是指将T细胞或体外T细胞表位多肽刺激产生的T细胞作为疫苗接种，用于治疗某些自身免疫疾病.但将依据MHC-I类分子特异的多肽结合基序(MHC binding motif)合成的多肽，在体外诱导产生的抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)，用于治疗病毒性疾病，则是近几年的新思维，新设想[16]，将T细胞从过去应用为靶细胞转变成效应细胞，为T细胞疫苗的概念增添了新的内涵.

    2.1 T细胞疫苗与CTL反应  自从Doherty和Zinkernagel发现CTL能够杀伤外源微生物感染细胞，而且这种杀伤作用依赖于CTL对外源多肽和自身分子(MHC)的双重识别之后，越来越多的研究表明:病毒特异性的CTL介导的细胞免疫具有清除病毒的功能，是宿主防御病毒感染的主要机制之一. 正因为此，CTL表位及CTL介导的细胞免疫应答的研究受到越来越多的关注. 传统的病毒疫苗(减毒或灭活)，含有完整的病毒蛋白质，以刺激机体产生抗体为主，难以有效诱导产生MHC-I类限制性的CTL和清除细胞内病毒颗粒. 目前临床应用的过继免疫治疗如LAK细胞、CD3-AK细胞均为非特异杀伤细胞，靶向性差.因此，有学者已直接用单个或多个CTL多肽导入体内(多肽疫苗)，诱导机体产生特异性CTL应答[17-19]，虽然能够观察到CTL应答，但有时滴度不高，可能是由于较短的CTL多肽更易被血清蛋白酶降解，从较短的(通常为几个-十几个氨基酸)多肽中去除一个或两个氨基酸将改变其结合HLA的能力;若将几个多肽交联，既可能形成新的CTL表位，诱导特异性CTL失败，又可能产生针对多肽的抗体; 另外，低剂量抗原皮下注射可以产生免疫应答，而高剂量静脉注射则可能引起免疫耐受.
 
    2.2 治疗病毒性肝炎  T细胞疫苗是用多肽在体外诱导产生特异性CTL，后者被克隆、扩增、筛选和鉴定后，仅将MHC-I类限制的CD8+ T细胞输入机体，诱导细胞免疫应答产生，从而解决了多肽疫苗存在的上述问题，而且直接回输CTL，可以人为地控制CTL的强度，避免其过度，导致大量受染肝细胞死亡，也可避免其过低，无清除病毒作用.
    
    治疗性疫苗被认为是抗病毒治疗的一个重要方向，已有研究者进行了探索. 其中DNA疫苗和HLA限制的识别HBc表位的细胞毒T淋巴细胞疫苗能够活化细胞和体液免疫应答. 在转基因鼠中，这种治疗性疫苗能够打破免疫耐受，但人体研究尚待开展. 因此，我们在国家自然基金的资助下，利用转染了HBV基因(S+S1)或(S+S1+S2)的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞皮下注射，形成的皮下移植瘤HBV小鼠模型和HBV基因转染细胞系，发现MHC-I限制的CTL表位多肽体外诱导的特异性CTL，在体内外对HBV感染细胞均具有杀伤作用，可能成为病毒性疾病或肿瘤免疫较好的疫苗后选之一[20,21].

3   树突状细胞疫苗

    树突状细胞(dendritic cell，DC)是专职抗原呈递细胞，能有效地将抗原呈递给 T 淋巴细胞，从而诱导CTL活化. 荷载抗原的DC具有疫苗的功能，故称树突状细胞疫苗.荷载的抗原既可以是病毒抗原、HLA限制的CTL 表位(8-10 个氨基酸的短肽)基因，也可以是肿瘤细胞，还可以是编码肿瘤抗原的基因.由于 DC 细胞疫苗可以不依赖于CTL靶细胞，又有较高的抗原呈递效率，正成为新一代疫苗的代表[22].

    3.1 研究意义及现状  核酸疫苗诱导特异性免疫应答产生已被大量的实验室证实，但普遍存在着抗体滴度不高，CTL杀伤率不强等问题. 其原因可能与病原体感染后，抗原呈递细胞(APC)，尤其是树突状细胞数量减少、功能降低有关[23-26]. 如何绕过或提高DC免疫功能低下，诱导出更强有力的、更具广泛性的免疫应答，应当成为基因疫苗和免疫治疗亟待解决的突出问题之一. 业已证实，DC是目前发现的功能最强的抗原呈递细胞，也是唯一能激活初始T细胞的抗原呈递细胞[27]. 因此，应用抗原或抗原多肽体外冲击致敏DC，然后将之回输或免疫接种荷瘤宿主或带病毒特异性抗原的宿主，进行免疫治疗；利用DC与肿瘤细胞融合成为新型带有DC功能及肿瘤特异抗原的融合细胞瘤苗的报道[28];以及利用病毒载体将带有肿瘤或病毒抗原的编码基因转染DC，使之在DC内持续表达相应特异性抗原，诱导产生特异性抗肿瘤或抗病毒免疫反应等方法应运而生.

    3.2 DC在HBV发病机制中的作用  近年来，越来越多的证据表明，由DC激活的细胞免疫特别是CTL介导的免疫反应，在HBV发病机制中发挥着十分重要的作用.一般认为，细胞免疫功能低下是HBV感染慢性化的主要原因.作为主要的抗原呈递细胞，DC的功能缺陷将直接影响T细胞的免疫反应. 已有实验证实DC可诱导肿瘤细胞免疫耐受，但婴幼期免疫耐受是否与此有关尚需进一步研究. Oka et al [29]使用HBV转基因鼠(HBVTg)模型研究PBMC来源的DC与免疫接种后应答的关系，发现疫苗接种后应答者DC功能明显强于无应答者. 在另一些实验中有潜在DC功能的HBV? Tg经免疫接种治疗后无HBsAg和HBeAg的表达，HBV DNA滴度也较低. DC功能较差者治疗前毫无反应，两组治疗前HBsAg、HBeAg和HBV DNA浓度无差异. 提示DC活化程度可作为判断免疫治疗预后的指标.研究发现，DC免疫可以打破HBVTg对CTL的免疫耐受，而且转基因鼠不能产生抗?HBs只与DC功能缺陷有关，与T、B细胞功能无关. 经IFN处理后DC可上调表达MHC和T细胞抗原(KLM). 国内外学者已有报道慢性乙型肝炎患者外周血DC功能明显低下，抗原呈递不足可能是导致HBV感染慢性化的原因之一[30].
    
   近年来，科学家在几种动物模型中进行了乙肝DNA病毒感染的“感染与免疫”机制研究，取得明显进展. 应用四聚体和细胞质内细胞因子染色在慢性乙型肝炎患者进行的细胞免疫应答的研究，阐明了慢性乙型肝炎的基础免疫缺陷. 这些基础实验研究对评价各种疫苗和候选疫苗的治疗作用是极其重要的. 1998年国外开始用乙肝病毒基因转移鼠为动物模型研究乙肝病毒治疗性疫苗的抗病毒作用. 同年在法国、日本也开始用乙肝病毒某些基因片段表达的多肽加上各种不同佐剂配制的治疗性疫苗作临床研究，观察这种多肽疫苗对慢性乙肝病毒携带者的治疗作用. 其结果揭示，这种疫苗对乙肝病毒基因转移鼠有抗病毒作用，单一应用特别是与抗乙肝病毒药联合应用，对慢性乙肝病毒携带者有一定的疗效. 1999年美国研制了新的多肽治疗性疫苗，并对这种治疗性疫苗的免疫学作用进行了深入研究. 美国这一研究具有很大意义，因为这一研究中，作者提出了一些免疫学检测方法，这些检测方法不仅可以预测治疗效果，而且还初步证明，治疗性疫苗可以打破慢性乙肝病毒感染患者最主要的免疫学反应紊乱，即对乙肝病毒及其抗原不产生免疫应答-免疫耐受状态. 我国学者闻玉梅et al报告，现在有多种治疗性乙肝疫苗正在进行临床前期或临床研究，由复旦大学与北京生研所合作开发的重组治疗性乙肝疫苗(YIC)已通过了国家药品监督管理局认证.

    免疫耐受是造成慢性乙肝病毒携带者呈持续病毒感染状态的主要原因之一，也是治疗上最难解决的问题. 现有治疗慢性乙肝的抗病毒药对慢性乙肝病毒携带者疗效不佳，其主要原因是这些抗病毒药可以抑制乙肝病毒复制，但不能清除乙肝病毒；对机体的免疫耐受状态的逆转没有肯定的作用. 从发展趋势来看，乙肝病毒治疗性疫苗将成为本世纪对慢性乙肝病毒感染特别是慢性乙肝病毒携带者治疗研究领域的热点，他与现有抗乙肝病毒药物的联合应用，将成为一种新的治疗方法.

4     参考文献 (略)