自身免疫性肝炎的动物模型

作者：佚名文章来源：肝病网点击数：更新时间：2015-3-11

核心提示：自身免疫性肝炎的动物模型的详细介绍，还有加强对自身免疫性肝炎诊治的研究及自身免疫性肝炎的分类各种肝病症状和治疗方法，肝病肝炎的相关知识等。

第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心，西安聂青和罗新栋

　　目前认为自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)是具有遗传易感性的个体在一个或多个环境因素的作用下引发的，而免疫调节失控可能是疾病发生发展的关键。但AIH明确的环境因素了解甚少，其遗传背景更为复杂。AIH的多基因性表明，单项免疫调节基因缺失的动物模型无法模拟其复杂的遗传背景。

　　AIH因诊断困难、确诊较晚，多基因遗传背景和组织标本的缺乏而难以开展研究工作。利用AIH动物模型可增加我们对AIH发病机制的了解，有助于探索新的治疗及预防方法。AIH动物模型在肝脏特异性免疫调节的研究中已被运用了近一个世纪，但迄今尚无标准的AIH动物模型[1]。特定MHC限制的近交系动物极大地简化了抗肝免疫反应的研究。

一、早期实验性肝炎的尝试

　　早在AIH被描述为一个独立病种以前，就进行了动物实验的尝试，Fiessinger(1908年)第一个描述了以胞核提取物注入兔腹腔内8次后出现ManBetX官网在线登录改变。然而以肝抗原注射Guinea猪却未见肝组织学损害。Casals和Olitsky以同源的肝匀浆连续10次注入小鼠腹腔，诱发了肝组织炎症浸润、点状坏死和肝纤维化。早期研究中免疫后未用佐剂而出现的肝损伤可以用抗原的异源性来解释。Behar等证明同源性肝抗原与Freund’s佐剂(CFA)联用可更有效地诱导肝损伤，认为佐剂可能激发了肝组织中“静止抗原的潜能”。提示引发自身免疫性疾病的模型对肝特异性免疫反应的重要性。Dodd等以不同大鼠或同源家兔的肝核糖体辅以CFA免疫家兔，诱发了门管周围的点状浸润，并证实是由抗核糖体抗体引发，并可有抗体转移。虽然这是第一次报道自身抗体引起的肝组织炎性浸润，但是该抗体是非肝特异性的，而且肝损伤仅是狼疮样综合征的一部分，尚包括溶血性贫血、白细胞减少以及在脾、心、脑、肾的病理变化。随后在家兔模型中证实以同种肝组织匀浆免疫产生的自身抗体不能转移针对肝组织的疾病。

二、家兔的慢性肝炎

　　在人慢性肝炎可见肝细胞坏死和反复的门脉周围浸润，并需要为期数月的多项免疫反应参与，而家兔实验形成的浸润存在时间短且从未引起肝纤维化或ManBetX官网在线登录。Scheiffarth 等证实肝组织匀浆中的胞浆碎片比微粒体碎片更有效，而胞核碎片未引起任何病理改变，并首先描述了引发免疫反应的可溶性肝抗原(soluble liver antigens，SLA)实为S-100(100,000 g supernatant of liver antigens)的一部分，35年后鉴定SLA为UGA抑制性tRNA相关抗原。在人AIH发生过程中该抗原的抗体目前仍是唯一的肝病特异性自身抗体。

　　Buschenfelde等用家兔模型的自身免疫血清鉴定了一种肝细胞膜抗原，称这种膜富集的脂蛋白为LSP(liver-specific protein)。虽然血清中的抗肝抗原抗体可与肝细胞结合，但该抗体与疾病活动的组织学变化无关，加之用免疫血清转移该病失败，提示在实验性自身免疫性肝炎中的作用依赖于细胞免疫。后来对家兔模型的研究发现了针对肝抗原的淋巴细胞增生。
上述肝抗原实际仍是混合物，从未真正鉴定出家兔模型的肝抗原。家兔无近交系模型，且实验需要人肝抗原，另外以对照抗原免疫一些动物的结果使人们对产生其特异性产生疑问，上述因素使该研究未能深入。

三、小鼠的实验性自身免疫性肝炎

　　Scheiffarth等(1967年)首先以异体肝组织匀浆和CFA在近交系小鼠诱导了实验性肝炎。12次连续免疫使65.17%(58/89)的小鼠发生轻微的门管周围浸润，13.48%(12/89)的小鼠发生广泛的门管周围浸润并肝细胞坏死。第一次描述了细胞因素对实验性肝炎所起的作用：疾病不能从免疫过的小鼠脾细胞、淋巴结细胞转移给同系小鼠。提示实验性肝炎依赖于细胞免疫。虽然疾病是由异体肝提取物引起，第一次过继转移给同系小鼠暗示一个真正的自身免疫反应。在第一个例子中以同系的肝提取物和CFA免疫未诱导肝损伤，强调了打破肝抗原免疫耐受的难度。

　　然而，Kuriki等最后成功地以同系肝组织匀浆或浓缩的LSP(佐剂为肺炎克雷白杆菌裂解物)在近交系SMA小鼠中诱发了实验性肝炎。小鼠至少每月免疫注射8次。除了肾脏极小的损伤外，疾病似乎是肝特异性的，能被脾细胞转移给照射过的同系小鼠。Mori等以肝组织匀浆S-100连续6次肌注诱发了实验性自身免疫性肝炎(experimental autoimmne hepatitis, EAH)。实验证明近交系小鼠C57/B6比Balb/c、C3H/He更容易诱导EAH并产生LSP自身抗体。证实了针对LSP的T细胞活化，可由脾细胞转移。此模型中LSP是否真正包含了自身抗原尚不明确，因为来自未经处理的小鼠脾细胞也显示了类似的LSP反应。

　　Bartholomaeus等发现无胸腺C57/B6裸鼠不能产生LSP抗体，显示了LSP抗体的T细胞依赖性。Watanabe 等发现组织学肝炎、LSP自身抗体的产生、对LSP的迟发型超过敏反应在新生胸腺切除的小鼠较显著。以同系S-100皮下注射A/J小鼠8次也导致EAH。目前仅有的报告，提出了体内肝特异性免疫应答中此调节系统的重要性。

　　Lohse(1990年)报道了小鼠EAH模型的改进。研究中单次腹腔内注射已足以引起持续性肝炎。免疫后6月仍然可见组织学改变。腹腔内注射S-100是最有效的，C57/B6小鼠比 Balb/c 和 C3H更显著。肝炎伴随了轻度的ALT升高，4周峰值为3倍正常高值。疾病可被免疫小鼠的ConA活化脾细胞所过继转移。研究中的不同鼠系的易感性反映了阻断肝免疫耐受时基因背景的重要性。

　　抗体在发病机制中可能未发挥关键作用。小鼠EAH诱导数周后特征性自身抗体才出现，在组织学变化和ALT已经复原后抗体滴度仍持续升高，而T细胞反应却先于肝组织学变化和ALT升高。反映了T细胞在介导肝细胞坏死时的重要作用。另外在EAH恢复初期脾细胞有一定的体外抑制作用，这些脾细胞不仅抑制对无关抗原的免疫应答、CD4+CD25+ T细胞调节活性的恢复，而且也抑制最初的肝特异性免疫应答。这可能与AIH的慢性复发有关。

　　近交系小鼠的EAH实验在肝特异性免疫反应的效应细胞及调节现象提供了有价值的信息，但没能诱导出慢性复发性AIH。目前实验产生的自身免疫抗体尚不能与人AIH的相比，也未鉴定出特异性自身抗原。

四、肝特异性免疫应答的研究与转基因小鼠

　　因自身抗原在前述的模型中属于未知，通过重组DNA技术在肝内表达设计的外来抗原可建立转基因模型。此方法的一个主要问题是胸腺中新基因的表达，导致抗原反应T细胞在与肝抗原接触前耐受性消失。至今没有外周自身抗原或组织特异性转基因不在胸腺髓质皮层细胞混合表达的。

　　转基因动物模型极大地增加了我们对肝特异T细胞活化、诱导免疫耐受的了解。现有结果表明若外来抗原单独在肝细胞表达，通过缺失、反应无能和受体下调等方式，可诱导T细胞的免疫耐受，可以推测早期免疫耐受的诱导失败导致了AIH。然而没有模型可产生如AIH所见的慢性复发性抗肝免疫反应。

　　Jones-Youngblood等(1998年)首先以肝特异性新抗原进行研究。MHC-I 分子 Q10作为融合蛋白与H-2Ld (Q10/L) 在受最小限度Q10作用的肝细胞膜表达。Q10/L表达经Northern blot检测为肝特异性，用同一方法在胸腺中未见阳性信号，也未见肝炎发生的迹象。同样在转基因动物肝炎不会因表达Q10/L的抗原呈递细胞(APCs)的转移而被诱导。与交叉抗原反应的Q10/L(+) CTLs可在转基因小鼠证实,但不如非转基因小鼠的CTLs有效。非转基因小鼠的抗原激活(但不是非激活的)脾细胞转移入Q10/L转基因小鼠可导致门管周围浸润。认为肝细胞膜上表达新抗原可导致抗原特异性T细胞的免疫耐受。

　　Morahan等以金属硫蛋白为增强剂表达了异型抗原H-2Kb ，在转基因小鼠或移植了非转基因小鼠骨髓的转基因小鼠，均未能见到自发的肝脏炎症浸润。除此以外，一个体液抗HBsAg反应加速了循环的HBsAg的清除，并导致了抗HBsAg的血清转换。有趣的是，将高滴度的抗HBs血清转移入Alb1-HBV小鼠，可诱导轻微的肝炎，提示抗原阳性肝细胞的杀伤是由抗体介导的。然而抗肝细胞免疫反应主要是由CD8+ T细胞介导的。一个抗原特异的、H-2Kd缺失的 CD8+ T细胞克隆被建立，可导致Alb1-HBV小鼠肝炎。尽管建立了CD8+T细胞诱导的免疫病理模型，但是自发的自身免疫反应没有继续，尚不清楚HBsAg的免疫耐受是如何建立的。

　　Ferber 等实验证明：通过缺失、无反应力和受体下调，新抗原单独在肝细胞表达可诱导T细胞的耐受。在C反应蛋白的增强下同种抗原H-2Kb在CRP-Kb小鼠内表达。甚至在CRP-Kb小鼠低于诱导剂量的Kb表达也导致同种皮肤移植的耐受。部分耐受是由TCP下调引起的。

　　Bertolino 等在Met-Kb小鼠以金属硫蛋白和Des-TCR-tg T细胞增强H-2Kb的表达，用于追踪肝特异性免疫反应。因为这个模型显示了胸腺表达的阴性选择，他们创建了胸腺嵌合体(切除胸腺Met-Kb小鼠后移植非转基因胸腺和Des-TCR-tg骨髓)。小鼠在3～5wk后重建骨髓渐萎缩时出现显著的自发性肝炎。

　　Voehringer等提出了一个病毒感染AIH模型。以白蛋白促使表达淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的 gp33表位(Alb-gp33小鼠)，LCMV gp33(H-2Db表达)特异性CD8+TCR-tg T细胞被用作为抗原特异性T细胞(P14TCR-tg)。虽然发展中的胸腺细胞属部分阴性选择，如果P14TCR-tg过继转移，肝细胞的新抗原将被忽略。

　　现有的研究一个不足为大多都用肝细胞表面强表达的同种异型抗原。同种异型抗原可被T细胞直接或间接(APC加工后)识别，尚不明确自身抗原也是否如此，因为自身抗原常由APC摄取和呈递。而且，异常反应的T细胞的增殖能力非常高，而自身免疫性疾病时T细胞增殖能力常偏低，免疫应答能力弱。另外大多研究着眼于孤立的CD8+T细胞反应，即使AIH与MHC－Ⅱ等位基因有较强的联系，是否CD4+细胞也是如此反应？

五、肝损伤的细胞因子模型

　　CD8+T细胞诱导的INF-γ、TNF-α在肝损伤时的作用已经被提及。几个模型已显示不同方式触发的INF-γ、TNF-α升高可导致肝组织炎症损伤、肝细胞凋亡和暴发性肝衰竭。INF-γ肝特异性表达可使血清转氨酶升高，出现随着年龄增长的类似慢性肝炎的变化。AIH患者的INF-γ、TNF-α阳性细胞数目与疾病活动有关。患联合免疫缺乏症的小鼠不会发生肝损伤。

　　CD1d缺陷小鼠(缺乏NKT细胞)不会出现ConA诱导的肝损伤。转移肝炎NKT细胞入CD1d缺陷小鼠并加用ConA可导致肝炎。NKT细胞须来自野生型小鼠，而不来自FasL缺乏的gld小鼠，提示FasL在NKT细胞表达参与了其发病机制。

六、AIH的基因模型

　　因为至今没有自发的AIH模型存在，不能象在其他模型中一样知道疾病的遗传易感性，在AIH患者也不能利用单基因缺陷来发现疾病的多基因性。设想抗炎性细胞因子的缺乏可引起器官特异性自身免疫性疾病。Balb/c背景的TGF-β小鼠可自发产生严重的肝炎，但不是一个明确的慢性肝炎自发模型，因2周后小鼠死亡发现有胚胎致死性。

　　自身免疫调节基因(autoimmune regulator gene,AIRE)突变的患者发生了自身免疫性多腺性综合征，10～15%的患者出现AIH，特征为出现抗细胞色素P450 2A6、1A2的自身抗体。具有固定AIRE突变的小鼠也显示肝内单核细胞浸润和肝特异性自身抗体，然而未见更多的特征性改变。

　　肝脏还是一个免疫器官，目前对其研究有了飞速的发展。例如发现肝窦状内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSEC)可诱导对循环的可溶性抗原的免疫耐受。肝免疫细胞在成分、活动状态、对抗原应答与其他器官是不同的，深入研究它们对了解免疫耐受和免疫反应性之间的平衡是至关重要的。然而，这方面AIH的进展落后于其他自身免疫性疾病，主要是因为目前尚无合适的AIH动物模型。

参考文献(略)

中医肝病专家